2017年8月17日，国际学术权威刊物自然出版集团《Nature》杂志在线发表了清华大学医学院布莱恩·克比尔卡 (Brian Kobilka)教授研究组与杜克大学罗伯特·莱夫科维茨教授研究组共同合作的一项研究成果。研究论文题为《利用X射线晶体结构揭示beta2肾上腺素受体胞内别构拮抗剂的工作机理》的文章 (Mechanism of intracellular allosteric β2AR antagonist reveled by X-ray crystal structure)。首次报道了beta2肾上腺素受体同时结合正构拮抗剂卡拉洛尔(carazolol)与胞内别构拮抗剂Cmpd-15的复合物结构。该成果对G蛋白偶联受体别构调节物的研发具有指导意义。医学院助理研究员刘翔宇博士与杜克大学佐恩科尔·安 (Seungkirl Ahn)博士为本文的共同第一作者，布莱恩·克比尔卡教授与罗伯特·莱夫科维茨教授为本文的共同通讯作者。

由于对G蛋白偶联受体结构和功能研究的杰出贡献，布莱恩·克比尔卡教授和罗伯特·莱夫科维茨教授分享了2012年的诺贝尔化学奖。G蛋白偶联受体是一类具有七次跨膜结构的膜蛋白受体。这类受体可以感知包括气味分子、激素、神经递质、趋化因子等信号，从而调节生理反应。G蛋白偶联受体是一类重要的药物靶标，大约30%的商业化药物以G蛋白偶联受体作为靶点。由于对G蛋白偶联受体结构和功能研究的杰出贡献，布莱恩·克比尔卡教授和罗伯特·莱夫科维茨教授分享了2012年的诺贝尔化学奖。

传统上针对G蛋白偶联受体的药物研发工作主要以其正构底物结合位点(即天然底物结合位点)为靶点。这类正构底物结合位点在不同亚型的G蛋白偶联受体之间往往非常保守。例如在人体中一共有九个肾上腺素受体，它们都可以被肾上腺素激活，所以其正构底物结合位点十分相似。这就导致研发出的药物往往对不同亚型的特异性不够，造成药物副作用。别构调节物指的是不结合在G蛋白偶联受体正构底物结合位点的小分子化合物。其结合位置通常保守性较低，因此有可能具有更好的特异性。目前报道的G蛋白偶联受体结构大多数都是结合了正构拮抗剂，只有极少数结构里面结合了别构调节物。布莱恩·克比尔卡教授自从在清华大学建立实验室以来，一直保持和世界上不同实验室合作，共同研发G蛋白偶联受体的别构调节物，并利用结构生物学的方法研究别构调节物发挥功能的分子机理。

胞内别构拮抗剂第15号化合物(Cmpd-15)是罗伯特·莱夫科维茨研究组利用亲和筛选的方式，从DNA编码的小分子化合物库里面鉴定出来的一个beta2肾上腺素受体别构拮抗剂 (Ahn, S. et al. 2017)。生化实验表明第15号化合物[XL1] 可能穿过细胞膜，结合在beta2肾上腺素受体的胞内位置。Beta肾上腺素受体的正构拮抗剂，即乙型阻滞剂(beta-blocker)是一类极为重要的处方药。而Cmpd-15是第一个别构型的乙型阻滞剂，其重要性不言而喻。

在这项工作中，布莱恩·克比尔卡研究组利用一个beta2肾上腺素受体和T4溶菌酶的融合蛋白(β2AR-T4L)进行晶体学研究。研究初期利用T4溶菌酶的融合蛋白与Cmpd-15共结晶，获得了2.5埃的晶体数据。但是由于胞内别构拮抗剂Cmpd-15[XL2] 溶解性很差，在结晶条件中最高只能加到200uM。在晶体数据里虽然看到胞内部分有很弱的电子密度，但是无法准确判断其结合方式。后来合作研究组对Cmpd-15进行了修饰，在其上加入一个羧酸聚乙二醇基团以提高其溶解度。改造后的小分子即为Cmpd-15PA。 布莱恩·克比尔卡研究组又获得了T4溶菌酶的融合蛋白与Cmpd-15PA复合物2.7埃的晶体结构。其晶体数据清楚的揭示了Cmpd-15的结合方式，羧酸聚乙二醇基团在晶体中处于柔性不可见的状态。Cmpd-15结合在跨膜螺旋1、2、6、7的胞内端与胞内环1以及螺旋8形成的底物口袋。结构分析、分子动态模拟以及生化实验结果表明Cmpd-15通过两种方式形成功能。一是通过稳定跨膜螺旋6，将beta2肾上腺素受体稳定在非激活状态，从而影响正构底物的亲和力。二是直接与下游信号蛋白如G蛋白或者抑制蛋白 (arrestin)竞争，干扰下游信号传导。

值得注意的是2016年12月《自然》期刊上曾经报道了两个趋化因子受体CCR2和CCR9与各自胞内别构调节物的复合物结构(Zheng, Y. et al. 2016。 Oswald, C. et al. 2016)。尽管小分子的化学结构很不一样，和小分子相互作用的氨基酸序列也不保守，但是本工作中肾上腺素能受体β2抗体 (β2AR)上的第十五化合物结合区域和趋化因子受体上的别构调节物结合区域在结构上很接近，都是由跨膜螺旋1、2、6、7的胞内部分组成。这表明该位置可能在不同类型的G蛋白偶联受体里面都可以作为别构调节物结合口袋，本工作对针对其他G蛋白偶联受体的别构药物研发工作具有指导意义。

beta2肾上腺素受体和Cmpd-15PA(即修饰后的cmpd-15)复合物的整体结构。其中a是Cmpd-15PA的化学结构，b是Cmpd-15PA活性数据，c是Cmpd-15PA的电子密度(晶体学数据)，d-f展示了复合物的整体结构，清楚表明Cmpd-15结合在beta2肾上腺素受体的胞内部分。

beta2肾上腺素受体和Cmpd-15PA结合的细节。

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原文摘要：

G-protein-coupled receptors (GPCRs) pose challenges for drug discovery efforts because of the high degree of structural homology in the orthosteric pocket, particularly for GPCRs within a single subfamily, such as the nine adrenergic receptors. Allosteric ligands may bind to less-conserved regions of these receptors and therefore are more likely to be selecive. Unlike orthosteric ligands, which tonically activate or inhibit signalling, allosteric ligands modulate physiologic responses to hormones and neurotransmitters, and may therefore have fewer adverse effects. The majority of GPCR crystal structures published to date were obtained with receptors bound to orthosteric antagonists, and only a few structures bound to allosteric ligands have been reported. Compound 15 (Cmpd-15) is an allosteric modulator of the β2 adrenergic receptor (β2AR) that was recently isolated from a DNA-encoded small-molecule library1. Orthosteric β-adrenergic receptor antagonists, known as beta-blockers, are amongst the most prescribed drugs in the world and Cmpd-15 is the first allosteric beta-blocker. Cmpd-15 exhibits negative cooperativity with agonists and positive cooperativity with inverse agonists. Here we present the structure of the β2AR bound to a polyethylene glycol-carboxylic acid derivative (Cmpd-15PA) of this modulator. Cmpd-15PA binds to a pocket formed primarily by the cytoplasmic ends of transmembrane segments 1, 2, 6 and 7 as well as intracellular loop 1 and helix 8. A comparison of this structure with inactive- and active-state structures of the β2AR reveals the mechanism by which Cmpd-15 modulates agonist binding affinity and signalling.